Cas12a2 provoque une infection abortive par l'ARN

Nov 06, 2023

Nature volume 613, pages 588–594 (2023)Citer cet article

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Les systèmes d'infection bactérienne abortive limitent la propagation des envahisseurs étrangers en fermant ou en tuant les cellules infectées avant que les envahisseurs ne puissent se répliquer1,2. Plusieurs systèmes CRISPR-Cas ciblant l'ARN (c'est-à-dire les types III et VI) provoquent des phénotypes d'infection abortive en activant des nucléases aveugles3,4,5. Cependant, un mécanisme abortif médié par CRISPR qui exploite l'activité DNase aveugle d'une nucléase à effecteur unique guidé par l'ARN n'a pas encore été observé. Nous rapportons ici que le ciblage de l'ARN par la nucléase à effecteur unique de type V Cas12a2 entraîne une infection abortive par clivage non spécifique de l'ADN double brin (ADNdb). Après avoir reconnu une cible d'ARN avec une séquence flanquante protospacer activatrice, Cas12a2 dégrade efficacement l'ARN simple brin (ssRNA), l'ADN simple brin (ssDNA) et le dsDNA. Au sein des cellules, l'activation de Cas12a2 induit une réponse SOS aux dommages à l'ADN et altère la croissance, empêchant la dissémination de l'envahisseur. Enfin, nous avons exploité l'activité collatérale de Cas12a2 pour la détection directe d'ARN, démontrant que Cas12a2 peut être réutilisé comme outil de ciblage d'ARN guidé par l'ARN. Ces découvertes élargissent les capacités défensives connues des systèmes CRISPR-Cas et créent des opportunités supplémentaires pour les technologies CRISPR.

Tous les domaines de la vie utilisent des stratégies de défense qui font entrer les cellules en dormance ou meurent pour limiter la propagation des agents infectieux1. Chez les bactéries et les archées, cette stratégie est appelée infection abortive et est utilisée par une grande variété de systèmes de défense bactériens1,2. Récemment, il a été démontré que les systèmes immunitaires adaptatifs guidés par l'ARN CRISPR (ARNcr) qui ciblent l'ARN provoquent des phénotypes d'infection abortive3,4,5,6. Les systèmes de type VI dégradent l'ARN de manière non spécifique, la nucléase à effecteur unique Cas13 agissant à la fois comme un effecteur guidé par l'ARNc et comme une RNase indiscriminée3,7,8. Dans les systèmes de type III, la liaison à l'ARN cible déclenche la production de messagers secondaires d'oligoadénylate cyclique qui, à leur tour, activent des RNases et des ssDNases accessoires aveugles qui peuvent conduire à une infection avortée4,5,9,10,11. De plus, il a été proposé que l'infection abortive soit médiée par des dsDNases aveugles (telles que NucC) activées par des messagers secondaires de type III12,13 ou par une activité ssDNase aveugle à partir de nucléases à effecteur unique Cas12a de type V14. Cependant, l'activité de la dsDNase médiée par CRISPR de type III n'a pas encore été examinée in vivo, et il a récemment été démontré que l'activité de la ssDNase de Cas12a ne provoque pas d'infection abortive15.

Nous rapportons ici que Cas12a2, une nucléase (Cas) associée à CRISPR à effecteur unique de type V, induit un phénotype d'infection abortive lorsqu'elle est mise au défi avec des plasmides complémentaires aux guides d'ARNcr. Des essais biochimiques utilisant une protéine recombinante ont révélé que Cas12a2 reconnaît les cibles ARN, libérant des activités non spécifiques d'ADNdb, d'ADNsb et d'ARNsb distinctes de celles d'autres nucléases Cas de ciblage d'ARN à sous-unité unique (telle que Cas13a) et d'ADNdb (telle que Cas12a). De plus, nous montrons que les activités nucléases non spécifiques de Cas12a2 endommagent l'ADN bactérien, déclenchant la réponse SOS et altérant la croissance cellulaire. Collectivement, ces résultats suggèrent que l'activité dsDNase de Cas12a2 joue un rôle déterminant dans le déclenchement du phénotype d'infection abortive. À titre de démonstration de preuve de principe, nous montrons que Cas12a2 peut détecter l'ARN à une sensibilité comparable à celle de la nucléase Cas13a ciblant l'ARN à différentes températures.

Cas12a2 comprend un groupe de nucléases effectrices de type V apparentées à Cas12a16, les orthologues de Cas12a2 étant auparavant classés comme variants de Cas12a18. Nos analyses les placent de la même manière dans un clade monophylétique qui partage le dernier ancêtre commun avec les nucléases Cas12a (Fig. 1a et Extended Data Fig. 1). Une analyse plus approfondie a révélé que les systèmes CRISPR – Cas12a2 et CRISPR – Cas12a comportent des répétitions CRISPR avec une extrémité 3 'conservée, et les nucléases possèdent des domaines d'endonucléase RuvC homologues et une structure secondaire prédite similaire dans les extrémités N (Fig. 1b et Fig. 2 supplémentaires). Malgré les domaines conservés de type RuvC et les terminaisons N, Cas12a2 se distingue de Cas12a par la présence d'un grand domaine de fonction inconnue situé à la place de l'hélice du pont Cas12a ainsi que d'un domaine à doigt de zinc à la place du domaine Cas12a Nuc (Fig. 1b et Fig. 2 supplémentaire). Compte tenu de leur classification originale combinée à nos analyses phylogénétiques ainsi qu'aux résultats structuraux récents19, nous avons nommé ces nucléases de type V distinctes Cas12a2.

a, Phylogénie à vraisemblance maximale des nucléases Cas12a2 identifiées avec les nucléases Cas12a et Cas12b. La phylogénie détaillée est illustrée dans les données étendues de la Fig. 1. Les systèmes avec Cas12a2 et Cas12a simultanés sont indiqués par des cercles rouges et bleus pleins. SuCas12a2 est indiqué par un cercle rouge vide. b, L'architecture de domaine de SuCas12a2 par rapport à LbCas12a. aa, acides aminés. c, Répétitions directes alignées associées aux nucléases Cas12a2 et Cas12a représentatives. Les nucléotides en gras indiquent des positions conservées dans les répétitions traitées pour les deux nucléases. La structure de pseudo-nœud prédite de la répétition Cas12a est illustrée ci-dessous. La boucle de l'épingle (gris) est variable. Le traitement pré-ARNcr par SuCas12a2 est illustré dans les données étendues Fig. 3. d, Organisation génique des systèmes CRISPR – Cas au sein de locus génomiques représentatifs codant pour Cas12a2. Des exemples de systèmes codant Cas12a2 comme seule nucléase Cas et ceux codant également Cas12a sont présentés. e, Schéma du test d'interférence plasmidique traditionnel (en haut ; sélection de nucléase cible (tns)) et modifié (en bas ; sélection de nucléase (ns)). Cm, chloramphénicol; Kan, kanamycine. f, La réduction de la transformation plasmidique pour SuCas12a2 et LbCa12a2 sous la sélection du plasmide cible et du plasmide nucléase. g, La réduction de la transformation plasmidique des mutants SuCas12a2 RuvC sous la sélection du plasmide cible et du plasmide nucléase. Pour f et g, les données sont la moyenne ± sd d'au moins trois expériences indépendantes lancées à partir de colonies séparées. Les valeurs P ont été calculées à l'aide des tests t de Welch unilatéraux ; NS, P > 0,05 ; *P < 0,05, **P < 0,005.

Notamment, certains systèmes CRISPR – Cas contiennent à la fois les gènes cas12a2 et cas12a en tandem à côté d'un réseau CRISPR partagé (Fig. 1c). À partir de cette observation et de la conservation des répétitions CRISPR des systèmes avec l'une ou l'autre des nucléases (Fig. 1d et Fig. 3 supplémentaire), nous avons émis l'hypothèse que les deux protéines se lient et traitent des guides d'ARNc similaires. Cependant, comme les protéines divergent dans d'autres domaines, nous avons en outre émis l'hypothèse que Cas12a2 exerce une fonction de défense distincte de l'activité de ciblage d'ADNdb de Cas12a16.

Pour tester ces hypothèses, nous avons codé le gène cas12a2 de l'epsilonproteobacterium Sulfuricurvum sp. PC08-66 (SuCas12a2) avec un tableau CRISPR dans un plasmide d'expression, que nous avons introduit dans des cellules d'Escherichia coli. Nous avons ensuite effectué un test d'interférence plasmidique traditionnel qui épuise les cellules en sélectionnant le plasmide contenant la nucléase et l'ARNc ainsi qu'un plasmide cible (Fig. 1e). Ce test détecte une large activité du système immunitaire mais ne peut pas faire la distinction entre les activités de défense qui appauvrissent uniquement la cible de celles qui activent les phénotypes d'infection abortive. Pour tester si Cas12a2 utilise un mécanisme d'infection abortive, nous avons modifié le test en sélectionnant uniquement le plasmide nucléase (Fig. 1e). Conformément à notre hypothèse selon laquelle Cas12a2 fonctionne différemment de Cas12a, Cas12a2 a appauvri les cellules dans les tests d'interférence plasmidique traditionnels (réduction d'environ 1 900 fois) et modifiés (réduction d'environ 1 300 fois), tandis que Cas12a de la bactérie Lachnospiraceae (LbCas12a) a appauvri les cellules uniquement dans le test traditionnel (Fig. 1f). Des tendances similaires ont été observées avec différentes cibles clonées dans le même emplacement de plasmide, différents homologues de Cas12a2 et lors de la comparaison de SuCas12a2 avec l'homologue de Cas12a de Prevotella bryantii B14 (Pb2Cas12a) (données étendues Fig. 2a, b). De plus, la mutation des résidus actifs prédits dans l'un des trois motifs RuvC dans SuCas12a2 a altéré la fonction immunitaire (Fig. 1g). Collectivement, ces résultats indiquent que Cas12a2 repose sur un domaine RuvC-nucléase et induit une infection abortive par un mécanisme distinct de celui de Cas12a.

Les systèmes CRISPR qui provoquent des phénotypes d'infection abortive (tels que les types III et VI) reposent sur des nucléases aveugles activées par le ciblage de l'ARN3,4,5. Pour déterminer si Cas12a2 utilise un mécanisme similaire, nous avons exprimé et purifié par recombinaison SuCas12a2 et testé ses activités enzymatiques in vitro (Fig. 2 et Fig. 4 supplémentaire). Cependant, avant d'examiner les activités de ciblage des acides nucléiques, nous devions déterminer comment les crARN Cas12a2 sont traités.

a, ciblage direct de différents substrats d'acides nucléiques marqués FAM par un complexe SuCas12a2 – ARNc purifié. b, clivage collatéral de substrats d'acide nucléique non ciblés marqués par FAM par le complexe SuCas12a2 – ARNcr avec différents substrats d'ARN cibles après 1 h. ARN cible, une séquence non auto flanquante à l'extrémité 3 '; auto-flanc, une séquence flanquante mutée en complément inverse de l'étiquette de répétition d'ARNcr ; pas de flanc, seulement le complément inverse du guide crRNA. Pour a et b, des diagrammes d'acides nucléiques cibles et non cibles sont présentés à droite. c, Analyse temporelle du clivage collatéral déclenché par l'ARN de l'ARN, de l'ADNss ou de l'ADNds non cible marqué. Des images de gel représentatives sont fournies dans Extended Data Fig. 4c. Notez que l'ADNdb contient deux fois plus de substrat d'ADNss que l'ARN et l'ADNss, mais la même concentration de brins marqués. d, L'effet de la mutation de chacun des trois motifs RuvC sur le clivage collatéral déclenché par l'ARN de l'ADNdb. e, Analyse temporelle du clivage collatéral déclenché par l'ARN de l'ADN plasmidique non cible. L'ADN plasmidique a été visualisé en utilisant du bromure d'éthidium. Pour a–d, les astérisques indiquent un substrat marqué FAM et les diagrammes de droite indiquent les substrats. Tous les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Les données de source de gel sont fournies dans la Fig. 1 supplémentaire.

Les répétitions CRISPR des systèmes Cas12a et Cas12a2 sont hautement conservées à l'extrémité 3 '(Fig. 1d et Fig. 3 supplémentaire), et les alignements de séquences prédisent que Cas12a2 partage la structure secondaire dans la région du site actif de traitement pré-ARNcr de Cas12a (Fig. 5 supplémentaire). Conformément à cette prédiction, l'analyse de séquençage de l'ARN des pré-ARNc traités par SuCas12a2 in vitro a révélé que le traitement se produit un nucléotide en aval de la position clivée par Cas12a (données étendues Fig. 3a, b). L'extrémité 3 'de l'espaceur a également subi une coupe in vivo pour former un guide d'environ 24 nucléotides (données étendues Fig. 3b, c), éventuellement via des ribonucléases hôtes, comme observé pour les ARNc Cas921. Les acides aminés basiques mutants (Lys784 et Arg785) situés dans le site actif prédit de traitement de l'ARN ont aboli l'activité22 (Extended Data Fig. 3d). De plus, des tests d'interférence plasmidique ont révélé que Cas12a et Cas12a2 peuvent échanger des guides sans altérer l'immunité (Extended Data Fig. 2c). Ainsi, la nucléase Cas12a2 traite ses propres guides d'ARNc comme les autres nucléases effectrices de type V20,23 et peut partager des ARNc avec Cas12a.

Pour déterminer la préférence de cible d'acide nucléique de Cas12a2 guidé par l'ARNcr, des substrats complémentaires d'ARNss, d'ADNss et d'ADNdb contenant une séquence flanquante riche en A / T (substrats Cas12a parallèles) 16,22 ont été marqués par fluorescence avec une molécule FAM et combinés avec Cas12a2 guidé par l'ARNcr (Fig. 2a). Semblable aux systèmes CRISPR-Cas qui provoquent une infection abortive, mais contrairement au Cas12a ciblant l'ADNdb, Cas12a2 n'est activé qu'en présence de cibles d'ARN complémentaires. La puissance de l'interférence plasmidique avec SuCas12a2 (Fig. 1f) était remarquable compte tenu de l'absence de promoteur défini en amont de la cible dans cette construction. Cependant, nous attribuons l'interférence à une fausse transcription du plasmide codant pour deux raisons : l'introduction d'un terminateur en amont a considérablement réduit l'interférence du plasmide dans E. coli (données étendues Fig. 2d, e), et un promoteur en amont était nécessaire pour détecter l'activité collatérale dans un essai de transcription-traduction sans cellule (données étendues Fig. 2f, g).

Comme d'autres mécanismes d'infection abortive de Cas reposent sur une activité collatérale aveugle de la RNase, nous avons examiné si le ciblage spécifique de l'ARN par Cas12a2 induit une activité aveugle de la nucléase. Nous avons constaté que SuCas12a2 dégradait de manière robuste et indiscriminée les substrats ssRNA, ssDNA et dsDNA marqués par FAM ne présentant aucune complémentarité avec le guide crRNA. En revanche, d'autres nucléases Cas dégradent indistinctement uniquement l'ARNss (Cas13a) 8 ou l'ARNss et l'ADNss (Cas12g) 25 après le ciblage de l'ARN, ou uniquement l'ADNss après le ciblage de l'ADNdb (Cas12a) 14 (Fig. 2b et Extended Data Fig. 4a). Parmi les trois substrats collatéraux, le ssRNA et le ssDNA semblent être plus efficacement clivés que le dsDNA par Cas12a2 (Fig. 2c et Extended Data Fig. 4b). Cependant, cette différence pourrait s'expliquer par la présence de deux fois plus de brins d'ADN dans les substrats d'ADNdb par rapport aux substrats d'ADNss pour la même quantité de nucléase. De plus, comme Cas13a8, l'ADNsb et l'ADNdb complémentaires n'activent aucune activité nucléase non spécifique de Cas12a2 (données étendues Fig. 4a) et l'ARNdb n'est pas un substrat principal du clivage collatéral (données étendues Fig. 4c).

Pour examiner si l'activité de Cas12a2 dépend de la détection d'un signal «non-soi» adjacent à la cible (appelé séquence flanquante de protospacer (PFS)) 8, nous avons effectué des tests de clivage in vitro dans lesquels les séquences d'ARN cibles étaient flanquées du côté 3 'avec une séquence «soi» complémentaire à la répétition d'ARNc (5′-AUCUA-3′), le PFS non-soi utilisé dans notre test in vivo (5′-GAAAG -3 ') ou un ARN «sans flanc» complémentaire de la région guide de l'ARNcr, mais ne contenant pas de PFS (Fig. 2b). Notamment, seule la cible d'ARN contenant l'activité de nucléase collatérale activée par PFS non autonome, démontrant que des nucléotides spécifiques à l'extrémité 3 'de la cible d'ARN doivent être présents pour activer l'activité collatérale de Cas12a2. De plus, l'introduction de mutations perturbatrices dans l'un des trois motifs RuvC ou des résidus de cystéine conservés dans le domaine putatif à doigts de zinc a aboli tout clivage non spécifique (Fig. 2d et Extended Data Fig. 4d), conformément à nos résultats d'interférence plasmidique in vivo (Fig. 1g).

Nos tests biochimiques ont démontré que Cas12a2 pouvait rapidement éliminer une étiquette FAM des substrats d'ADNdb linéaires, mais il n'était pas clair si Cas12a2 dégradait l'ADN dépourvu d'extrémités 5 'ou 3' disponibles. Nous avons donc défié Cas12a2 guidé par l'ARNcr avec une cible d'ARN et un plasmide pUC19 superenroulé. Il est important de noter que pUC19 ne contient aucune séquence complémentaire du guide Cas12a2 crRNA. Nous avons observé que SuCas12a2 coupait, linéarisait et dégradait rapidement l'ADN de pUC19 (Fig. 2e), mais uniquement en présence d'une cible apparentée et d'une PFS et avec un domaine RuvC intact (Extended Data Fig. 4e). Cette destruction rapide du plasmide superenroulé contraste avec la linéarisation lente et incomplète de l'ADN plasmidique par les nucléases Cas12a26. Ces données suggèrent un mécanisme dans lequel SuCas12a2 activé est capable d'hydrolyser de manière robuste le squelette phosphodiester de l'ADN non spécifique, qu'il soit superenroulé, entaillé ou linéaire. Une comparaison avec Cas12a (ciblage d'ADNdb avec ssDNase collatérale), Cas13a (ciblage d'ARNss avec ssRNase collatérale) et Cas13g (ciblage d'ARNss avec ssRNase et ssDNase collatérales) a démontré que les ssRNase, ssDNase et dsDNase ciblant l'ARN sont uniques à SuCas12a2 (Extended Data Fig. 4a). Collectivement, ces résultats in vitro révèlent que les ARNcr guident SuCas12a2 vers les cibles ARN, activant le clivage dépendant de RuvC de l'ARNss, de l'ADNss et de l'ADNds. Ces activités, en partie ou en totalité, peuvent sous-tendre le phénotype d'infection abortive.

Bien que nos données in vitro aient indiqué un mécanisme sous-jacent au phénotype d'infection abortive Cas12a2, nous voulions comprendre les limites de ciblage de ces enzymes distinctes. En particulier, nous avons étudié la rigueur de la reconnaissance de la séquence PFS non-soi et les pénalités pour les mésappariements entre l'ARNc et la cible. Nous avons donc défié SuCas12a2 avec une bibliothèque de plasmides codant toutes les 1 024 séquences flanquantes possibles à l'extrémité 3 'de l'ARN cible en position -5 (Fig. 3a et Données étendues Fig. 5a, b). Nous avons constaté que SuCas12a2 appauvrissait environ la moitié de toutes les séquences de la bibliothèque, suggérant un mécanisme de reconnaissance PFS plus strict que celui de Cas13 mais toujours plus promiscueux que ceux de la plupart des systèmes de ciblage d'ADN8,27. Les séquences appauvries étaient généralement riches en A, compatibles avec une PFS en 5′-GAAAG-3′, mais n'ont pas pu être entièrement capturées par un seul motif consensus (Fig. 3a et Extended Data Fig. 5c). Nous avons en outre validé des séquences appauvries individuelles, y compris des représentants au sein de cinq motifs uniques reconnus par SuCas12a2 mais pas par Pb2Cas12a, une nucléase connue pour la reconnaissance PAM flexible24 (Fig. 3b et Extended Data Fig. 5d). Conformément à sa fonction de nucléase ciblant l'ARN, les séquences reconnues étaient larges mais ne suivaient pas le profil attendu si Cas12a2 évalue principalement la complémentarité tag-anti-tag. Ces résultats soutiennent en outre un mécanisme dans lequel la reconnaissance de la PFS par SuCas12a2 fonctionne de manière similaire aux systèmes de type III qui nécessitent la reconnaissance d'une PFS ou d'un ARN PAM pour s'activer28,29,30,31 et distinct de l'évaluation de la complémentarité tag-anti-tag utilisée par l'ARN ciblant Cas138,32 et d'autres systèmes CRISPR-Cas de type III33.

a, PFS et motifs déterminés expérimentalement reconnus par SuCas12a2 dans E. coli. Les motifs capturant les positions −4 à −1 de la PFS sont représentés et sont écrits de 3′ à 5′. B représente C, G ou U; K représente G ou U; R représente G ou A; W représente A ou U; et Y représente C ou U. Les résultats sont représentatifs de deux écrans indépendants (Extended Data Fig. 5). b, Validation des PFS sélectionnées identifiées dans l'écran et permissives de ciblage par SuCas12a2 mais pas Pb2Cas12a. c, L'effet des mésappariements de guide sur le ciblage plasmidique par SuCas12a2 dans E. coli. d, L'étendue de l'inhibition par les protéines AcrVA connues contre SuCas12a2. Il a été confirmé que les protéines Acr présentent une activité inhibitrice contre différents homologues de Cas12a dans E. coli ou dans des réactions de transcription-traduction sans cellule (Extended Data Fig. 5). Les données sont la moyenne ± écart-type d'au moins trois expériences indépendantes démarrées à partir de colonies séparées. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de tests t de Welch unilatéraux.

La plupart des nucléases Cas ciblant l'ADN et l'ARN ont montré une sensibilité élevée aux mésappariements dans une région de graine, dans laquelle un seul mésappariement entre le guide d'ARNc et la cible perturbe la liaison8,17,34,35. Ainsi, pour déterminer si SuCas12a2 repose sur une région de graine, nous avons évalué comment SuCas12a2 tolère les mésappariements dans notre test cellulaire (Fig. 3c). Notamment, SuCas12a2 a accueilli des mésappariements simples et doubles à travers la cible, les mutations PFS-distales exerçant des effets plus néfastes sur le ciblage plasmidique. Pour perturber complètement le ciblage de SuCas12a2, quatre mésappariements étaient nécessaires tout au long du guide (Fig. 3c) ou jusqu'à 10 mésappariements à l'extrémité 3 'd'un guide de 24 nucléotides (Extended Data Fig. 6a). La reconnaissance flexible de la PFS et une tolérance aux inadéquations guide-cible indiquent que SuCas12a2 présente une reconnaissance de cible promiscuité et semble manquer d'une graine canonique hypersensible aux inadéquations guide-cible34,35. Cependant, l'appariement nécessaire avec l'extrémité 3 'du guide est cohérent avec le fait que cette extrémité est pré-ordonnée dans la structure du complexe binaire crRNA-Cas12a219 et peut-être initiant l'appariement de bases avec la cible. De plus, la promiscuité a en outre permis à SuCas12a2 de reconnaître les mutations cibles qui perturbent le ciblage par Cas12a (Extended Data Fig. 6b).

Collectivement, les activités distinctes de Cas12a2 par rapport à Cas12a suggèrent que les systèmes en tandem possédant les deux nucléases (Fig. 1d) peuvent agir en coopération pour élargir l'efficacité contre les virus et les plasmides étrangers. En particulier, nous avons émis l'hypothèse que les caractéristiques structurelles uniques de Cas12a2 pourraient empêcher la fuite des virus codant pour des protéines anti-CRISPR qui bloquent la fonction de Cas12a36,37,38. Conformément à cette hypothèse, une seule (AcrVA2.1) sur sept protéines anti-CRISPR Cas12a a pu altérer la fonction de Cas12a2, bien que partiellement (Fig. 3d et Supplémentaire Fig. 6a, b). Notamment, AcrVA5 n'a également présenté aucune activité inhibitrice malgré le fait que SuCas12a2 possède le résidu de lysine conservé dans Cas12a qui est chimiquement modifié par cet Acr pour bloquer la reconnaissance de PAM39 (Fig. 3d et Fig. 6c supplémentaire). La capacité limitée des protéines Cas12a Acr à inhiber SuCas12a2 souligne davantage les propriétés distinctes de ces nucléases et la capacité de Cas12a et Cas12a2 à se compléter dans la défense immunitaire.

Bien que nos premiers résultats indiquent que Cas12a2 provoque un phénotype d'infection abortive, un scénario était que Cas12a2 déclenché éliminait sélectivement tous les plasmides, permettant aux cellules de succomber à toute sélection antibiotique introduite. Pour évaluer cette possibilité, nous avons évalué la croissance d'E. coli en culture liquide dans différentes conditions de sélection d'antibiotiques (y compris une condition sans antibiotique) après induction de SuCas12a2 et LbCas12a à l'aide d'un crARN ciblant (Fig. 4a et Supplémentaire Fig. 7). SuCas12a2, mais pas LbCas12a, a supprimé la croissance de la culture en l'absence de sélection plasmidique, soutenant davantage l'induction d'un phénotype d'infection abortive par Cas12a2.

a, arrêt de la croissance d'E. coli en présence du plasmide SuCas12a2, LbCas2a2 ou LsCas13a dans différentes conditions de ciblage et régimes antibiotiques. A600, absorbance à 600 nm. b, Le pourcentage de cellules E. coli colorées avec de l'iodure de propidium (PI) indiquant une perte de viabilité avant le ciblage (non induit) et après 4 h de ciblage (induit) sans sélection antibiotique. La stratégie de déclenchement est illustrée dans la Fig. 7 supplémentaire. c, L'étendue variable de la dégradation de l'ARN dans E. coli par SuCas12a2, LbCas12a ou LsCas13a2 2 h après induction sans sélection antibiotique. Les résultats représentent des expériences indépendantes en double. Voir Données étendues Fig. 7 pour les quadruples indépendants. Le petit pool d'ARN comprend les ARNt et d'autres petits ARN. d, expression sensible au SOS de la GFP dans E. coli après 4 h de ciblage plasmidique par SuCas12a2, LbCas12a ou LsCas13a sans sélection antibiotique. Les données d'évolution dans le temps sont présentées dans la Fig. 9 supplémentaire. RFU, unités de fluorescence relatives. e, Teneur relative en ADN dans E. coli après 4 h de ciblage par SuCas12a2, LbCas12a ou LsCas13a sans sélection antibiotique. La fluorescence et la taille des cellules du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ont été mesurées par cytométrie en flux. Chaque cercle ou paire de cercles alignés verticalement représente les principales sous-populations du même réplicat biologique. Les tracés de contour correspondants sont illustrés dans les données étendues Fig. 8. FSC, diffusion vers l'avant. f, test de détection d'ARN. La limite de détection d'ARN avec Cas12a2 incubé avec une balise ssRNA à température ambiante (RT). Les données sont moyennes ± sem de trois expériences indépendantes. g, Cibles et rapporteurs d'acide nucléique ainsi que la limite de détection non amplifiée (LOD) pour Cas12a2 et d'autres détecteurs Cas46. Aap, Alicyclobacillus acidiphilus; Lwa, Leptotrichia wadei; Lbu, Leptotrichia buccalis. h, Le modèle proposé pour le ciblage de l'ARN promiscueux et la dégradation collatérale par SuCas12a2 et son effet sur la cellule. Pour b et d, les données sont la moyenne ± sd de quatre expériences indépendantes lancées à partir de colonies séparées. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de tests t de Welch unilatéraux. NT, plasmide non cible ; T, plasmide cible.

Une question ouverte est de savoir si le phénotype d'infection abortive a été causé par la dormance cellulaire ou la mort cellulaire. Il a été récemment montré qu'après avoir reconnu une cible d'ARN, Cas13a induit une dégradation généralisée de l'ARN qui entraîne la dormance cellulaire et supprime l'infection par les phages3. Nous avons donc introduit le représentant Cas13a de Leptotrichia shahii (LsCas13a) dans notre test de culture liquide. Semblable à SuCas12a2, LsCas13a a supprimé la croissance même en l'absence de sélection plasmidique (Fig. 4a et Fig. 7 supplémentaire).

Notre comparaison avec LsCas13a a suggéré que la suppression de la croissance par SuCas12a2 pourrait se produire par clivage non spécifique de l'ARN, provoquant la dormance cellulaire, alors que nos données in vitro ont indiqué que le clivage non spécifique de l'ADNdb pourrait également supprimer la croissance en provoquant la mort cellulaire. Pour évaluer si les cellules contenant SuCas12a2 subissaient la mort cellulaire, nous avons effectué un test de viabilité cellulaire en utilisant de l'iodure de propidium pour Cas12a2 et Cas13a. Nous n'avons observé qu'un faible pourcentage (environ 10%) de mort cellulaire pour Cas12a2 et Cas13a après 4 h (Fig. 4b et Fig. 8 supplémentaire). Ainsi, bien que les activités nucléases aveugles de Cas12a2 provoquent une certaine mort cellulaire, le résultat principal de l'activité de Cas12a2 est mieux décrit comme un phénotype de dormance cellulaire.

Bien que Cas12a2 semble provoquer la dormance, il n'était pas clair lesquelles des nombreuses activités nucléases aveugles sont impliquées. Pour déterminer si SuCas12a2 provoque la dormance par clivage de l'ARN, les ARN cellulaires totaux ont été examinés dans des conditions de ciblage et de non ciblage. Alors que Cas13a a appauvri de manière significative à la fois les ARNr et le petit pool d'ARN (qui comprend les ARNt), Cas12a2 n'a appauvri de manière significative que le petit pool d'ARN (Fig. 4c et Extended Data Fig. 7).

Compte tenu des différences observées dans la dégradation de l'ARN dans des conditions de ciblage, nous avons examiné si l'activité dsDNase aveugle de SuCas12a2 était détectable dans le contexte du phénotype d'infection abortive. Nous avons estimé que des dommages généralisés à l'ADNdb causés par SuCas12a2 déclencheraient une réponse SOS, altérant la croissance40,41. Conformément à cette affirmation, le ciblage plasmidique à l'aide de SuCas12a2 a induit de manière significative l'expression de la GFP à partir d'une construction de rapporteur sensible au SOS 42 par rapport à un témoin non cible, tandis que LbCas12a et LsCas13a ont induit de manière négligeable l'expression de la GFP (Fig. 4d et Fig. 9 supplémentaire). De plus, les cultures ciblant SuCas12a2 ont divergé en deux sous-populations en l'absence de sélection antibiotique: l'une représentée par des cellules compactes à faible teneur en ADN et l'autre représentée par des cellules filamenteuses à forte teneur en ADN (Fig. 4e et Extended Data Figs. 8 et 9). Les cultures exprimant LbCas12a et LsCas13a ne présentaient pas de différences notables dans la taille des cellules et la teneur en ADN pour les plasmides cibles et non cibles. Des études antérieures avec d'autres systèmes CRISPR-Cas ciblant spécifiquement le chromosome bactérien ont observé des changements morphologiques similaires43,44,45, suggérant que ces morphologies distinctes sont dues à des dommages à l'ADNdb. Ces résultats démontrent que le ciblage de l'ARN par SuCas12a2 provoque des dommages à l'ADNdb du chromosome bactérien qui à son tour induit la réponse SOS et l'infection abortive chez les bactéries, reflétant un mécanisme distinct d'immunité qui repose sur l'activité dsDNase aveugle. Conformément à cette observation, des structures récentes de cryo-microscopie électronique ont révélé que Cas12a2 se lie à l'ADNdb et le coupe par un mécanisme complètement distinct de toutes les autres nucléases associées à CRISPR, et des mutants guidés par la structure avec une dsDNase collatérale in vitro altérée mais pas les activités ssRNase et ssDNase ont aboli l'activité de défense in vivo contre les plasmides19.

Les nucléases à effecteur unique CRISPR ont été réutilisées pour de nombreuses applications, de l'édition de gènes au diagnostic moléculaire. Pour déterminer si Cas12a2 pourrait être réutilisé comme outil biotechnologique, nous avons coopté SuCas12a2 pour détecter l'ARN. Nous avons programmé l'apo SuCas12a2 avec un guide d'ARNc complémentaire d'une cible d'ARN et avons incubé le complexe avec une balise d'ADNss ou d'ARNss qui devient fluorescente après clivage en raison de la séparation d'un fluorophore et d'un quencher (Fig. 4f). En utilisant cette approche, nous avons pu détecter l'ARN en utilisant à la fois des sondes d'ADNss et d'ARNss à 37 ° C et à température ambiante, avec une limite de détection dans la plage observée pour d'autres nucléases Cas à sous-unité unique46 (Fig. 4f et Extended Data Fig. 10a – c). De plus, nous avons conçu un test de détection modifié qui utilise l'ADN plasmidique et la traduction de coupure d'ADN47, introduisant une lecture positive distincte pour les diagnostics basés sur CRISPR (Extended Data Fig. 10d – f). Ces données indiquent que Cas12a2 peut être facilement réutilisé comme outil pour des applications dans les domaines de la science, de la biotechnologie, de l'agriculture et de la médecine. Nous prévoyons que les activités uniques de cette enzyme pourront être davantage exploitées pour étendre la boîte à outils basée sur CRISPR.

Collectivement, nos données soutiennent un modèle dans lequel les nucléases Cas12a2 présentent une dégradation déclenchée par l'ARN de l'ADNdb cytoplasmique et des petits ARN, entravant la croissance des cellules hôtes et provoquant un phénotype d'infection abortive (Fig. 4h). Ce mécanisme contraste avec la clairance ciblée de l'envahisseur ou les activités d'infection abortive présentées par d'autres systèmes CRISPR-Cas. Plus précisément, le mécanisme présenté par Cas12a2 rappelle le système de défense CBASS récemment décrit, qui repose sur la DNase NucC double brin aveugle qui dégrade l'ADN de la cellule hôte et tue la cellule12. Notamment, certains systèmes de type III codent pour les enzymes NucC, ce qui suggère que d'autres systèmes CRISPR-Cas ont évolué de manière convergente pour utiliser un mécanisme similaire d'infection abortive dégradant l'ADN13,48.

En plus d'endommager le génome et d'induire la réponse SOS, SuCas12a2 présente une reconnaissance d'ARN promiscuité grâce à une PFS flexible et à une tolérance aux mésappariements. Cette flexibilité dans la reconnaissance des cibles reflète la flexibilité de la complémentarité tag-anti-tag observée avec les systèmes de type III et VI8,33 et pourrait être particulièrement avantageuse contre les phages en évolution rapide, bien que les orthologues Cas12a2 doivent être caractérisés pour déterminer si une telle promiscuité est une caractéristique commune de ces nucléases. Bien que flexible, la PFS empêcherait toujours l'auto-reconnaissance de la fausse transcription antisens du réseau CRISPR, car la partie correspondante contenant la PFS de la répétition diverge fortement de la PFS reconnue - une caractéristique standard de l'auto/non-auto-reconnaissance pour les PAM dans les systèmes CRISPR-Cas ciblant l'ADN49. La flexibilité de la PFS et de la reconnaissance des cibles pourrait en outre servir de mécanisme de secours si la reconnaissance et la clairance précises des cibles ADN par Cas12a échouent dans les organismes qui codent à la fois pour Cas12a et Cas12a2 adjacents à un seul réseau CRISPR (Fig. 1a, d et Données étendues Figs. 1 et 6b). Cette stratégie à double nucléase s'apparenterait à des bactéries codant plusieurs systèmes CRISPR-Cas ciblant le même envahisseur50. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre comment ces deux nucléases fonctionnent ensemble pour contrer les infections.

La combinaison de la biogenèse de l'ARNc médiée par la nucléase, du ciblage de l'ARN et du clivage collatéral de l'ARNss, de l'ADNss et, en particulier, de l'ADNdb distingue Cas12a2 des autres nucléases Cas connues. Le besoin apparent de reconnaître la séquence flanquante riche en A par SuCas12a2 pour activer l'activité aveugle de la nucléase RuvC indique fortement que Cas12a2 doit se lier à une PFS correcte adjacente à la cible d'ARN pour activer le clivage plutôt que de s'appuyer uniquement sur la complémentarité entre l'étiquette répétée et la paire anti-étiquette cible pour se distinguer des séquences non autonomes, typiques de plusieurs autres nucléases et complexes Cas ciblant l'ARN8,33,51,52. L'étude de la base moléculaire sous-jacente de la reconnaissance de la cible et de l'activation du clivage collatéral par Cas12a2 pourrait révéler de nouveaux mécanismes utilisés par les nucléases CRISPR pour faire la distinction entre les cibles du soi et du non-soi. Les structures récentes de cryo-microscopie électronique de Cas12a2 aux stades du ciblage de l'ARN et de la capture collatérale de l'ADNdb répondent déjà à ce besoin19.

Cas12a2 détient un potentiel substantiel pour les technologies CRISPR. En tant que démonstration de preuve de principe, nous avons montré que SuCas12a2 peut être réutilisé pour la détection d'ARN avec une limite de détection comparable aux outils existants basés sur un seul effecteur46. Au-delà de la capacité à détecter l'ARN, nous envisageons une variété d'applications SuCas12a2 qui élargissent et améliorent la trousse d'outils basée sur CRISPR. Le clivage de l'ADNdb déclenché par l'ARN pourrait permettre la destruction programmable des cellules procaryotes et eucaryotes avec diverses applications, y compris la mise en forme programmable des communautés microbiennes, la thérapeutique du cancer et la contre-sélection pour améliorer l'édition du génome. De plus, la capacité de Cas12a2 et Cas12a à utiliser la même séquence d'ARNr tout en reconnaissant des espèces d'acides nucléiques distinctes (ARN versus ADNss et ADNds) et induire des activités de clivage non spécifiques distinctes (ARNss, ADNss et ADNds (Cas12a2) versus ADNss (Cas12a)) pourrait augmenter les applications Cas12a existantes en incorporant Cas12a2. En explorant davantage les propriétés de SuCas12a2 et de ses orthologues, nous prévoyons l'avènement de technologies CRISPR nouvelles et améliorées qui pourraient largement bénéficier à la société.

Plusieurs séquences Cas12a2 ont été initialement identifiées et provisoirement classées comme codant pour les nucléases Cas12a16. Ces séquences de protéines Cas12a2 ont été utilisées comme graines pour les recherches BLASTp de données sur les protéines dans NCBI et pour les recherches tBLASTn de données métagénomiques dans NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) et JGI (https://img.jgi.doe.gov) pour identifier des nucléases Cas12a2 putatives supplémentaires.

Les séquences d'acides aminés des orthologues Cas12a2, Cas12a et Cas13b ont été alignées à l'aide de MAFFT (v.7.490)53. L'alignement résultant a été ajusté à l'aide de ClipKIT54 et utilisé pour créer une phylogénie de probabilité maximale à l'aide de RAxML-NG55 avec les paramètres suivants : --model JTT+G --bs-metric fbp, tbe --tree pars{60}, rand{60} --seed 12345 --bs-trees autoMRE. Les séquences Cas13b ont été utilisées comme groupe externe. Les séquences d'acides aminés utilisées dans la création de la phylogénie sont fournies dans le fichier supplémentaire 1.

Les motifs conservés dans SuCas12a2 ont été identifiés à l'aide de MOTIF Search (https://www.genome.jp/tools/motif/, consulté le 15 juin 2021) et Phyre 256 (consulté le 8 mars 2021). Les prédictions de la structure secondaire HHpred des séquences d'acides aminés orthologues de Cas12a2 ont été réalisées pour identifier la structure secondaire commune entre Cas12a2 et Cas12a qui prédisait le site de traitement de l'ARNc de Cas12a257.

Toutes les expériences in vivo, sauf indication contraire, ont été réalisées dans E. coli BL21(AI). Pour la propagation, les cultures ont été cultivées dans un milieu LB à 37 ° C avec une agitation constante à 225–250 tr/min. La souche TOP10 d'E. coli a été utilisée pour le clonage de plasmide (tableau supplémentaire 1 (onglet 1)). Toutes les amorces, gBlocks et oligos ont été obtenus auprès d'Integrated DNA Technologies, sauf indication contraire. L'assemblage Gibson de la construction plasmidique a été réalisé à l'aide du NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs, E2621). La mutagénèse des plasmides, y compris les petites insertions et les substitutions de nucléotides, a été réalisée à l'aide du kit de mutagénèse dirigée Q5 (New England Biolabs, E0554S). Toutes les nucléases ainsi que l'ARNc, sauf indication contraire, ont été exprimées à partir de plasmides contenant l'origine de réplication p15A et un marqueur de résistance au chloramphénicol. L'expression des nucléases et de l'ARNc a été contrôlée par un promoteur T7, sauf indication contraire. Tous les plasmides cibles et non cibles ont été créés en introduisant des séquences de protospacer et des séquences flanquantes correspondantes dans des plasmides d'origine de réplication pBR322 ou sc101 portant une cassette de résistance à la kanamycine, sauf indication contraire. Les séquences codant pour les orthologues Cas12a2 (fichier supplémentaire 1) ont été optimisées en codons et synthétisées par Genscript. Séquences codant Pb2Cas12a de P. bryantii B14 (NCBI : WP_039871282) LbCas12a de L. bacterium ND2006 (NCBI : WP_035635841.1), FnCas12a de Francisella tularensis (NCBI : WP_104928540.1), AsCas12a de Acidaminococcus sp. BV3L6 (NCBI : WP_021736722.1) et Mb3Cas13a de Moraxella bovoculi (NCBI : WP_080946945.1)16 ont été optimisés en codons pour l'expression dans E. coli et commandés sous forme de gBlocks auprès d'Integrated DNA Technologies. Les séquences codant pour les protéines anti-CRISPR36,38 (tableaux supplémentaires 1 et 3) ont été optimisées en codons pour l'expression dans E. coli et commandées sous forme de gBlocks auprès d'Integrated DNA Technologies. Les gènes acr ont ensuite été amplifiés par PCR et introduits dans le squelette du plasmide pBAD24 portant une cassette de résistance à l'ampicilline58. Le plasmide pCBS2091 codant pour LsCas13a a été commandé chez Addgene (79150)8. Pour détecter la réponse SOS dépendante de RecA dans E. coli BL21 (AI), les plasmides rapporteurs pCBS2000, pCBS3611 et pCBS3616 ont été créés en introduisant le promoteur recA, inclus 100 pb en amont du site de liaison LexA prédit, en amont du gène codant pour la GFP dans le plasmide pCBS198. Les plasmides pCBS3611 et pCBS3616 ont reçu une cassette de résistance à l'ampicilline du plasmide pCB67224. La séquence du promoteur recA a été identifiée dans le génome d'E. coli BL21(AI) entre les positions 2 635 525 et 2 635 347 (NCBI : CP047231.1). Les plasmides témoins pCBS3616 et pCBS2002 sans les gènes rapporteurs GFP ont été générés par amplification PCR de pCBS2000 et pCBS3616 suivie d'un assemblage KLD (New England Biolabs, M0554). Une liste complète des plasmides utilisés dans l'étude, y compris des liens vers des cartes de plasmides, est fournie dans les tableaux supplémentaires 1 et 2. Une liste des séquences pertinentes d'oligonucléotides, d'ADNdb et d'ARN est fournie dans les tableaux supplémentaires 1 et 3.

SuCas12a2 WT étiqueté N-terminal 6 × His et des constructions mutantes ont été exprimées dans des cellules E. coli Nico21 (DE3) à partir d'un plasmide pACYC dépourvu de (apo) (plasmide 1416) ou contenant un réseau CRISPR à trois espaceurs (guidé par ARNc) (plasmide 1408) en utilisant soit l'auto-induction, soit l'induction d'isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG). La croissance par auto-induction a été réalisée conformément aux directives précédemment rapportées59. En bref, une solution contenant des concentrations recommandées de milieu ZY, MgSO4, mélange de métaux, 5052 (0,5 % de glycérol, 0,05 % de glucose, 0,2 % d'α-lactose) et des tampons d'auto-induction NPS ainsi que des antibiotiques nécessaires à la sélection a été inoculée avec des bactéries à partir d'un stock de glycérol ou d'une nouvelle transformation. Les cellules ont été cultivées pendant 5 h à 37 ° C sous agitation à environ 250 tr/min, puis déplacées à 24 ° C où elles ont été incubées pendant 24 h avant collecte par centrifugation à 8 000 tr/min pendant 25 min. Les culots cellulaires ont ensuite été stockés à -80 ° C jusqu'à purification. Pour l'induction IPTG, 1 litre de milieu TB a été inoculé avec 20 ml de croissance pendant la nuit et a été cultivé à 37 ° C jusqu'à une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,6. Les cellules ont ensuite été soumises à un choc froid sur de la glace pendant 15 min et induites avec de l'IPTG 0, 1 mM, suivies d'une incubation de 16 à 18 h à 18 ° C. Les cellules ont été recueillies par centrifugation. Les cellules ont été lysées par sonication dans un tampon de lyse (25 mM Tris pH 7,2, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM MgCl2, 10% glycérol) en présence de leupeptine, aprotinine, pepstatine, AEBSF et lysozyme. Le lysat a été clarifié par centrifugation à 36 400 g pendant 35 min. Le lysat clarifié a été ajouté à 5 ml de résine Ni-NTA et lié par lot à 4 ° C pendant 30 min, puis lavé avec 100 ml de tampon de lyse. La protéine a été éluée avec 50 ml de tampon d'élution Ni (Tris 25 mM pH 7,2, NaCl 500 mM, imidazole 250 mM, MgCl2 2 mM, 10 % de glycérol). Les fractions contenant SuCas12a2 ont été dessalées à l'aide de la colonne de dessalage Hiprep 26/10 dans un tampon à faible teneur en sel (25 mM Tris-pCas12a22, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 % de glycérol). SuCas12a2 + crRNA a ensuite été appliqué sur une colonne échangeuse d'anions Hitrap Q HP, tandis que l'apo SuCas12a2 a été appliqué sur une colonne échangeuse de cations Hitrap SP HP. La colonne a été lavée avec un tampon à haute teneur en sel à 10 % (Tris 25 mM pH 7,2, NaCl 1 M, MgCl2 à 2 mM, 10 % de glycérol) suivi d'une élution en gradient vers un tampon à haute teneur en sel 100 % 10 CV (50 ml). Les fractions contenant SuCas12a2 ont été concentrées à l'aide d'un concentrateur MWKO 100 kDa jusqu'à environ 1 ml puis purifiées par chromatographie sur colonne d'exclusion stérique sur une colonne Hiload 26/600 Superdex 200 pg équilibrée en tampon SEC (100 mM HEPES pH 7,2, 150 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10% glycérol). Les fractions contenant SuCas12a2 ont été concentrées et stockées à -80 ° C.

Pour le traitement d'un pré-ARNc 3 ×, l'ARN pré-CRISPR × 3 de SuCas12a2 a été transcrit in vitro à l'aide du kit de synthèse d'ARN à haut rendement HiScribe T7 (New England Biolabs). L'ADN matrice a été dérivé du plasmide 1409 de Jackson Laboratory se linéarisant avec l'enzyme de restriction Kpnl. Une bande contaminante qui s'étend approximativement à 130 nucléotides s'est avérée être un artefact de la réaction. De nombreuses stratégies ont été tentées pour empêcher la transcription de cette bande contaminante, sans succès. L'ARN transcrit in vitro a été nettoyé à l'aide de colonnes de centrifugation RNeasy (Qiagen). Ensuite, 1,5 μM d'apo SuCas12a2 ont été incubés avec 1 mg d'ARN SuCas12a2 pré-CRISPR × 3 dans un tampon 1 × 3,1 de New England Biolabs (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mg ml-1 BSA pH 7,9) et incubés à 25 ° C pendant plusieurs temps. Les échantillons ont été passés sur un gel (polyacrylamide à 12%, 8 M, TBE) à côté d'une échelle à faible portée d'ARNss (New England Biolabs) et colorés avec de l'or SYBR (Thermo Fisher Scientific).

Pour le traitement d'un crRNA 1 × avec des mutants de traitement WT et crRNA, un crRNA synthétique avec un surplomb non traité de 13 bases 5 '(smcrRNA; tableaux supplémentaires 1 et 3) a été replié à l'aide d'un protocole décrit précédemment60. Dans une réaction de 10 μl, 150 nM de substrat d'ARNc ont été combinés avec 1,5 μM de protéine WT, K784A ou K785A apo SuCas12a2 dans NEB 3.1. Les réactions ont été incubées à 37 °C pendant 1 h. Les réactions ont été désactivées avec du phénol et une extraction au phénol-chloroforme a été effectuée. Les résultats ont été analysés en utilisant 12% d'urée-PAGE colorée avec SYBR Gold.

Pour l'analyse du clivage ciblé, des réactions de 10 μl de 250 nM de SuCas12a2 – ARNcr avec 100 nM d'oligonucléotide synthétique complémentaire marqué par FAM (c'est-à-dire ADNss, ADNds ou ARN) dans un tampon 1 × NEB 3.1 ont été incubées à 37 ° C pendant 1 h. Les réactions ont été désactivées avec du phénol, puis une extraction au phénol-chloroforme a été effectuée. Les résultats ont été analysés à l'aide d'une méthode FDF-PAGE précédemment décrite et visualisés pour la fluorescence de la fluorescéine.

Pour l'analyse du clivage collatéral, 10 μl de réactions de 250 nM de SuCas12a2-ARNcr, et 250 nM de substrat cible (ARN complémentaire au guide d'ARNc) ou non cible (ARN non complémentaire au guide d'ARNc) et 100 nM de substrat collatéral marqué au 5′-FAM (ADNsb, ADNdb, ARN) dans 1 × NEB 3.1 ont été incubés à 37°C pendant 1h. Les réactions ont été désactivées avec du phénol, puis une extraction au phénol-chloroforme a été effectuée. Les résultats ont été analysés à l'aide d'urée-PAGE à 12 % et visualisés pour la fluorescence de la fluorescéine.

Pour l'analyse des exigences de séquence flanquante pour l'activation, réactions de 10 μl de 250 nM Cas12a2 – ARNcr, avec 300 nM de différents ARNss cibles (auto (flanqués d'une séquence complémentaire à la répétition directe de l'ARNc), sans flancs et flancs contenant un 5′-GAAA-3′ PFS sur le côté 3′ du protospacer) et 100 n M d'ADNdb collatéral 5′-FAM dans un tampon 1 × NEB 3.1 ont été incubés à 37 ° C pendant 1 h. Les réactions ont été désactivées avec du phénol et une extraction au phénol-chloroforme a été effectuée. Les résultats ont été analysés à l'aide d'urée-PAGE à 12 % et visualisés pour la fluorescence de la fluorescéine.

Pour l'analyse cinétique du clivage collatéral, une seule réaction de 100 μl contenant 100 nM Cas12a2 – ARNcr, 100 nM d'ARNsb cible (ARNcr complémentaire) et 100 nM de différents substrats collatéraux marqués au 5′-FAM (ADNsb, ADNdb, ARN) dans un tampon 1 × NEB 3.1 a été réalisée. Des points de temps ont été pris à 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60, 120 et 180 min en combinant 10 μl de la réaction de 100 μl avec du phénol, puis en effectuant une extraction au phénol-chloroforme. Les résultats ont été analysés à l'aide d'urée-PAGE à 12 % et visualisés pour la fluorescence de la fluorescéine.

Pour le test de clivage du plasmide, une réaction de 100 μl contenant 14 nM Cas12a2 – ARNcr, 25 nM d'ARN cible, 7 nM de plasmide pUC19 dans un tampon 1 × NEB 3.1 a été incubée à 37 ° C. Aux points de temps indiqués, 10 μl de la réaction ont été retirés et trempés avec du phénol et une extraction au phénol-chloroforme a été effectuée. Les réactions ont été visualisées sur de l'agarose à 1 % avec du bromure d'éthidium.

EnGen LbaCas12a (LbCas12a) a été acheté auprès de New England Biolabs (M0653S). Les réactions (10 μl) contenant 250 nM de LbCas12a et 500 nM de son ARNc apparenté dans un tampon 1 × NEB 2.1 ont été incubées à 37 ° C avec 200 nM de différents substrats cibles (ADNss, ADNds, ARN) et 100 nM de différents substrats collatéraux marqués FAM (ADNss, ADNds, ARN). Après 1 h, les réactions ont été stoppées par du phénol et une extraction au phénol-chloroforme a été effectuée. Les résultats ont été analysés à l'aide d'urée-PAGE à 12 % et visualisés pour la fluorescence de la fluorescéine.

LwCas13a a été acheté chez MCLAB Molecular Cloning Laboratories (Cas13a-100). Les réactions (10 μl) contenant 250 nM de LwCas13a et 500 nM de son ARNc apparenté dans le tampon 1 × Cas9 fourni (20 mM HEPES (pH 6,5), 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 100 μM EDTA) ont été incubées à 37 ° C avec 200 nM de différents substrats cibles (ssDNA, d ADNsb, ARN) et 100 nM de différents substrats collatéraux marqués FAM (ADNss, ADNds, ARN). Après 1 h, les réactions ont été stoppées par du phénol et une extraction au phénol-chloroforme a été effectuée. Les résultats ont été analysés à l'aide d'urée-PAGE à 12 % et visualisés pour la fluorescence de la fluorescéine.

AbCas12g a été exprimé dans E. coli NiCo 21 DE3 en utilisant pET28a-mH6-Cas12g1 (plasmide Addgene, 120879) et initialement purifié comme décrit précédemment25. La protéine a ensuite été transférée dans un tampon à faible teneur en sel (25 mM HEPES pH 7,8, 50 mM NH4Cl, 2 mM MgCl2, 7 mM BME, 5% de glycérol) par échange de tampon et chargée sur de l'héparine suivie d'une élution avec un gradient linéaire de NaCl et filtration sur gel comme décrit précédemment62. La protéine purifiée a été congelée rapidement et stockée à -80 ° C. Le plasmide non codant Cas12g1 pACYC-Cas12g1 (plasmide Addgene, 120880) a été utilisé comme matrice pour l'amplification par PCR de la séquence AbCas12g tracrRNA avec les amorces Cas12gtracrRNA F et R (tableaux supplémentaires 1 et 3) dans 2 × Taq Master Mix (New England Biolabs). Le plasmide non codant a été éliminé avec DpnI par incubation à 37 ° C pendant 1 h dans du tampon CutSmart (New England Biolabs). Les composants d'ADN ont été nettoyés après PCR et digestion DpnI à l'aide du kit EZNA Cycle Pure (OMEGA BioTek). Le tracrRNA Cas12g a été transcrit à l'aide du kit de synthèse d'ARN HighScribe T7 Quick High Yield et nettoyé à l'aide du kit de nettoyage Monarch RNA (New England Biolabs). Les réactions (10 μl) contenant 250 nM de Cas12g, 500 nM de Cas12g crRNA et 1 μΜ de Cas12g tracrRNA dans 1× NEB 3.1 buffer ont été incubées à 37 °C ou 50 °C avec 200 nM de différents substrats cibles (ssDNA, dsDNA, RNA) et 100 nM de différents collatéraux marqués FAM substrats (ADNss, ADNds, ARN). Après 1 h, les réactions ont été stoppées par du phénol et une extraction au phénol-chloroforme a été effectuée. Les résultats ont été analysés à l'aide d'urée-PAGE à 12 % et visualisés pour la fluorescence de la fluorescéine.

Pour analyser l'activité collatérale SUAS12A2, 10 μL de réactions contenant 250 nm de Cas12A2 - CRNA, 200 nm de différents substrats cibles (ADNsb, ADNdb, ARNdb) et 100 nm de différents substrats collatéraux de FAM-marquée (SSDNA, ADNA, RNA) dans 1 × NEB 3.1 Buffer a été incuté à 37 ° C pour 1 h. Les réactions ont été désactivées avec du phénol et une extraction au phénol-chloroforme a été effectuée. Les résultats ont été analysés à l'aide d'urée-PAGE à 12 % et visualisés pour la fluorescéine.

Cas12a2 (100 nM) a été complexé avec du crARN (120 nM) dans un tampon NEB 3.1 (50 mM Tris-HCl pH 7,9, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 µg ml-1 BSA) avant de combiner avec la RNase ou la DNase Alert (200 nM, IDT) et l'ARN cible aux concentrations indiquées dans une plaque 384 puits (Greiner Bio-One, 784077). Un contrôle de fond a été préparé avec de l'eau sans nucléase au lieu de l'ARN cible. Les réactions ont été surveillées pour la fluorescence du rapporteur (RNase Alert : excitation 485-20/émission 528-20, DNAse Alert : excitation 500-20/émission 560-20) au fil du temps dans des conditions ambiantes (température ambiante) ou à 37 °C à l'aide du lecteur de microplaques multimode Synergy H4 Hybrid (BioTek Instruments). La pente de la région linéaire (entre 5 et 30 min) a été déterminée à chaque concentration d'ARN cible à l'aide de GraphPad PRISM. L'erreur type de l'ajustement linéaire a été utilisée comme approximation de l'écart type, et la limite de détection a été calculée comme 3 × l'erreur type du fond d'eau comme décrit précédemment46. La limite de détection a été estimée en déterminant où le tracé de V0 (unités de fluorescence relatives (RFU)/s) par rapport à la concentration d'ARN cible croise le seuil de détection.

Les réactions de clivage plasmidique ont été préparées en combinant 14 nM de SuCas12a2 (ou mutant) avec 14 nM d'ARNc et 25 mM d'ARN cible dans un tampon NEB 3.1 (50 mM Tris-HCl pH 7,9, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 µg ml-1 BSA). La protéine a été préchauffée à 37 ° C pendant 15 min avant l'ajout de 7 nM de plasmide pUC19 surenroulé. Les échantillons ont été prélevés aux points temporels 1, 2, 5, 10, 20, 30, 45 et 60 min et trempés dans du phénol-chloroforme à pH 8,0. Les réactions désactivées ont été mélangées par effleurage suivi d'une centrifugation. Les échantillons ont été chargés sur des gels d'agarose à 1 % et visualisés à l'aide de bromure d'éthidium. Les gels ont été imagés à l'aide du système d'imagerie ChemiDoc MP (Bio-Rad).

Le plasmide pSPC421 a été collecté à partir de cellules TOP10 E. coli à l'aide du kit ZymoPURE II Plasmid Midiprep de Zymo Research (D4201) et nettoyé à l'aide du kit DNA Clean & Concentrator-5 de Zymo Research (D4013). ca33Cas12a2 a été exprimé à partir du plasmide pCBS5042 et purifié comme décrit ci-dessus au Rudolf Virchow Center for Integrative and Translational Bioimaging. La nucléase ca33Cas12a2 (100 nM) a été incubée avec le crARN (1 µM) dans le tampon NEB3.1 pendant 30 min à température ambiante. L'ARN cible CAO1 (1 nM) et pSPC425 (3 µg) ont été ajoutés au milieu réactionnel pendant 15 min. Pour évaluer l'entaille du plasmide, les échantillons ont été chauffés à 80 ° C pendant 1 à 30 min. Les réactions ont été effectuées sur un gel d'agarose à 0,8 %. L'ADN polymérase I (NEB, M0209L) a été ajoutée à la réaction (0,2 U µl-1) avec le mélange de marquage Atto421-NT (1 ×) et le tampon de marquage NT (1 ×) du kit de marquage Atto425 NT (Jena Bioscience, PP-305S-425). Les échantillons ont été incubés à 15°C pendant 90 min dans un thermocycleur Bio-Rad. Les fragments d'ADN marqués résultants ont été purifiés en utilisant les colonnes Microspin S-400 HR (Cytiva, 27514001). Les mesures de fluorescence (𝛌exc = 436 nm ; 𝛌em = 484 nm) ont été effectuées sur un lecteur de plaque de microtitration à fluorescence (BioTek NeoG2) à 25 °C.

Le plasmide d'expression SuCas12a2 pCBS3568 contenant les séquences codant pour la nucléase et l'ARNc et le contrôle sans ARNc pCBS3569 ont été transformés dans E. coli BL21 (AI) et les transformants ont été étalés sur des plaques de sélection. Les colonies résultantes ont été prélevées et utilisées pour inoculer 2 ml de cultures liquides pendant la nuit. Le lendemain, les cultures d'une nuit ont été utilisées pour inoculer 25 ml de LB contenant du chloramphénicol à une DO6oo d'environ 0,05. Une fois que les cultures en croissance ont atteint une DO6oo de 0,25 après environ 40 min, l'expression de la nucléase et de l'ARNc a été induite avec 1 mM d'IPTG et 0,2 % de l-arabinose. Les cultures induites ont été recueillies en phase stationnaire par centrifugation à 14 000 tr/min à 4 °C pendant 2 min. Les culots cellulaires ont ensuite été immédiatement congelés dans du N2 liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à un traitement ultérieur.

L'ARN total a été purifié à partir de culots cellulaires à l'aide du Direct-zol RNA Miniprep Plus (Zymo Research, R2072) conformément aux instructions du fabricant. L'ADN a été éliminé à l'aide de Turbo DNase (Life Technologies, AM2238). Entre les étapes de traitement individuelles, l'ARN a été purifié à l'aide du kit RNA Clean & Concentrator (Zymo Research, R1017). L'ARN ribosomal a été retiré des échantillons à l'aide du kit d'isolement du transcriptome RiboMinus, bactéries (Thermo Fisher Scientific, K155004). Les groupes 3'-phosphoryle ont été éliminés de l'ARN à l'aide de la polynucléotide kinase T4 (New England Biolabs, M0201S). La synthèse de l'ADNc et la préparation de la bibliothèque ont été réalisées à l'aide du NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set pour Illumina (New England Biolabs, E7330S). La sélection de la taille des fragments entre 200 pb et 700 pb a été effectuée à l'aide du kit Select-a-Size DNA Clean & Concentrator (Zymo Research, D4080). Enfin, l'ADN a été purifié à l'aide de billes AMPure XP (Beckman Coulter, A63882) et quantifié à l'aide du kit de test Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Q32851) sur DeNovix DS-11 FX (DeNovix).

Le séquençage de la bibliothèque a été effectué dans les installations GMAK du Centre Helmholtz de recherche infectieuse (HZI) à Braunschweig, en Allemagne, à l'aide de la méthode de séquençage MiSeq 300 (Illumina). La qualité des lectures appariées résultantes a été contrôlée, découpée et fusionnée à l'aide de BBTools63 (https://sourceforge.net/projects/bbmap/). Ensuite, les lectures ont été cartographiées sur le site d'expression de l'ARNc sur le brin positif de pCBS273 à l'aide de Bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/). Les données de séquençage brutes et traitées associées ainsi que les étapes de traitement des données peuvent être trouvées sur le NCBI Gene Expression Omnibus (GEO : GSE178531).

Des tests de clairance plasmidique standard ont été effectués dans E. coli BL21 (AI) contenant des plasmides exprimant la nucléase et l'ARNc. Les cultures bactériennes ont été cultivées pendant la nuit et utilisées pour inoculer un milieu LB frais contenant du chloramphénicol à une DO600 de 0,05 à 0,1. Par la suite, ces cultures ont été cultivées jusqu'à ce que la DO6oo atteigne environ 0,25, moment auquel 1 mM d'IPTG et 0,2 % de l-arabinose ont été ajoutés pour l'induction. Une fois que les cultures ont atteint une DO600 de 0,6 à 0,8, les cellules ont été collectées et rendues électrocompétentes64. Des cellules électrocompétentes ont été préparées à partir de quatre répliques biologiques. Immédiatement après, 1 µl de 50 ng µl-1 du plasmide cible et non cible ont été électroporés dans 50 µl de cellules E. coli électrocompétentes. Pour obtenir des efficacités de transformation élevées, les plasmides utilisés ont été purifiés par précipitation à l'éthanol et quantifiés à l'aide du kit de test Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Q32851). Les cellules électroporées ont été récupérées pendant 1 h à 37 ° C avec agitation dans 500 ul de LB contenant 1 mM d'IPTG et 0, 2% de l-arabinose sans antibiotiques. Ensuite, les cultures ont été diluées séquentiellement à 10-5 par incréments de dix. Ensuite, 5 à 10 µl de chaque dilution ont été déposés sur des plaques LB contenant des antibiotiques pour sélectionner la nucléase-ARNc et les plasmides cibles/non cibles. Les plaques contenaient également 0,3 mM d'IPTG et 0,2 % de l-arabinose. Les plaques ont été incubées pendant une nuit à 37°C.

Le lendemain, les colonies ont été comptées manuellement et les comptages résultants ont été ajustés pour le facteur de dilution. Les comptages de la dilution dénombrable la plus élevée ont été utilisés pour calculer la réduction du facteur de transformation sous la forme d'un rapport entre les colonies dans la condition non cible divisées par les colonies dans la condition cible.

Dans une modification de l'essai utilisé pour déterminer le phénotype de suicide cellulaire, les plasmides cibles et non cibles ont d'abord été transformés dans E. coli BL21(AI). Ensuite, ces cellules ont été rendues électrocompétentes et les plasmides nucléase-ARNcr ont été transformés en dernier.

Lors du test Acrs, le plasmide Acr (ampicilline) et le plasmide nucléase-ARNcr (chloramphénicol) ont été co-transformés, suivis d'une électroporation du plasmide cible ou non cible (kanamycine).

Pour étudier la croissance des cultures dans des conditions de ciblage de nucléase, la nucléase-ARNcr et les plasmides cibles/non cibles ont été transformés dans E. coli BL21(AI). Les transformants résultants ont été récupérés dans du milieu SOC et cultivés pendant une nuit avec du glucose à 0,2 % pour inhiber l'expression de la nucléase et de l'ARNc. Le matin, les cellules ont été recueillies par centrifugation à 5 000 g pendant 2 min. Les culots ont été remis en suspension dans du LB et utilisés pour inoculer 200 ul de milieu LB sur une plaque à 96 puits jusqu'à une DO6oo finale de 0,01. Selon l'expérience, les réactions contenaient différentes combinaisons d'antibiotiques, d'IPTG et de l-arabinose. Les plaques ont été incubées dans le lecteur de plaques BioTek Synergy H1 à 37°C sous agitation vigoureuse. La DO600 des cultures a été enregistrée toutes les 3 min. Des essais de clairance plasmidique ont été effectués avec les cultures d'une nuit, comme décrit ci-dessus.

Pour déterminer les préférences PFS de SuCas12a2, un test d'épuisement PFS a été effectué. Une banque d'oligo (ODpr23) constituée de combinaisons de 1 024 nucléotides à la place d'un site codant pour la PFS à 5 nucléotides a été synthétisée par Integrated DNA Technologies. En utilisant la bibliothèque d'oligo pools ODpr23 en combinaison avec l'amorce ODpr24, le plasmide pCBS276 ciblant a été amplifié par PCR à l'aide de la polymérase Q5 (New England Biolabs, M0543). Les produits de PCR ont été purifiés sur gel à l'aide du kit de récupération d'ADN sur gel Zymoclean (Zymo Research, D4007) et ligaturés à l'aide du mélange réactionnel KLD (New England Biolabs, M0554). Les plasmides ligaturés ont été purifiés par précipitation à l'éthanol et électroporés dans E. coli TOP10. Au total, dix réactions d'électroporation ont été réalisées. Après récupération des cellules électroporées dans le milieu SOC, les réactions individuelles ont été combinées pour inoculer 90 ml de milieu LB contenant de la kanamycine. Un total de 10 ul de chaque réaction d'électroporation a été étalé sur un milieu LB sélectif pour estimer le nombre total de bactéries transformées. Avec le nombre de colonies, nous avons estimé que le nombre total de cellules transformées dépassait le nombre de séquences PAM uniques dans la bibliothèque (1 024) d'environ 2 300 fois. L'ADN de la bibliothèque de plasmides a été purifié à partir de la culture combinée d'une nuit à l'aide du kit ZymoPURE II Plasmid Midiprep (Zymo Research, D4201) et en outre nettoyé par précipitation à l'éthanol. Ensuite, la banque de plasmides a été vérifiée par séquençage Sanger.

La bibliothèque de plasmides PAM a été transformée en E. coli BL21(AI) électrocompétent contenant soit le plasmide pCBS273 exprimant la nucléase SuCas12a2, soit un plasmide témoin pCBS3569 vide. Les cellules électrocompétentes ont été préparées comme décrit ci-dessus. Environ 600 ng de l'ADN plasmidique ont été électroporés dans un volume de 50 ul des cellules compétentes. Les bactéries transformées ont été récupérées dans 500 µl de milieu SOC pendant 1 h à 37 °C et ont été utilisées pour inoculer 50 ml de LB avec 1 mM d'IPTG et 0,2 % de l-arabinose en présence de kanamycine et de chloramphénicol. Les cultures ont été cultivées pendant 13 h avant que les cellules ne soient collectées par centrifugation à 4 000 g pendant 15 min et l'ADN plasmidique extrait à l'aide du kit ZymoPURE II Plasmid Midiprep (Zymo Research, D4201). Après récupération, les bactéries ont également été étalées sur des plaques LB contenant de la kanamycine et du chloramphénicol sans les inducteurs. Ces plaques ont été utilisées pour estimer le nombre total de cellules transformées avec la banque de plasmides. Le nombre total de cellules transformées estimé sur la base du nombre de colonies a dépassé le nombre de séquences PAM uniques dans la bibliothèque d'environ 1 700 fois pour les cellules contenant le plasmide SuCas12a2 – ARNcr (pCBS273) par rapport à 11 900 fois dans le contrôle sans ARNcr (pCBS3569).

La région de l'ADN plasmidique contenant le site cible comprenant la séquence codant pour la PFS a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces ODpr55 et ODpr56. Les réactions de PCR ont été purifiées à l'aide de billes AMPure XP (Beckman Coulter, A63882). Les produits de PCR purifiés ont été indexés à l'aide des amorces ODpr58, ODpr60, ODpr59 et ODpr61. Les produits de PCR indexés ont été purifiés à l'aide des billes AMPure XP, quantifiés à l'aide du test Qubit (Thermo Fisher Scientific, Q32851) et envoyés pour séquençage à l'installation HZI GMAK à l'aide de la méthode de séquençage MiSeq PE300 Illumina.

L'analyse des données d'appauvrissement de la séquence d'encodage PFS ainsi que la création des roues PFS ont été effectuées comme décrit précédemment65. Les motifs de consensus PFS ont été définis manuellement. Les données de séquençage brutes et traitées ainsi que les étapes de traitement des données peuvent être trouvées au NCBI GEO (GSE178530). Les séquences PFS individuelles ont été validées à l'aide d'essais de clairance de plasmide comme décrit ci-dessus.

Pour les tests in vitro visant à tester la sensibilité Acr des nucléases Cas12a, les plasmides codant la nucléase Cas12a ont été pré-exprimés avec un plasmide codant pour un ARNc cible ou non cible dans 9 µl de mélange maître MyTXTL (Arbor Biosciences) à une concentration finale de 4 nM pour chaque plasmide dans un volume total de 12 µl. Les Acr ont été pré-exprimés séparément, à une concentration de 4 nM dans un volume total de 12 µl. Comme les Acr sont codés sur des fragments d'ADN linéaires, GamS à une concentration finale de 2 µM a été ajouté pour empêcher la dégradation de l'ADN. Toutes les pré-expressions ont été réalisées à 29 ° C pendant 16 h. Le test de clivage ultérieur a été effectué en ajoutant 1 µl de chaque réaction de pré-expression à 9 µl de mélange myTXTL frais. Le plasmide pCBS420 exprimant de manière constitutive la protéine deGFP a été utilisé comme rapporteur à une concentration finale de 1 nM. Pour la quantification, quatre répliques de 3 µl par réaction ont été transférées sur une plaque à fond en V à 96 puits (Corning Costar 3357). Les réactions ont été préparées en utilisant le Echo 525 Liquid Handler (Beckman Coulter). La fluorescence a été mesurée sur le lecteur de plaques BioTek Synergy H1 (excitation, 485/20 ; émission, 528/20). Les mesures temporelles ont été effectuées pendant 16 h à 29 ° C, avec des intervalles de 3 min entre les mesures.

Toutes les valeurs de répression des plis pour les constructions de rapporteurs de plasmide représentent le rapport des concentrations de deGFP après 16 h de réaction pour le non-cible sur le crRNA cible. Pour les expériences mesurant l'activité inhibitrice d'Acrs, l'inhibition a été calculée à partir des valeurs d'expression au point final après 16 h d'expression selon la formule suivante66 : pourcentage d'inhibition de l'activité nucléase = 100 × (RFUt,Acr/RFUnt,Acr − RFUt,-/RFUnt,-)/(1 − RFUt,-/RFUnt,-), où l'inhibition de l'activité nucléase (%) est définie par le rapport de fluorescence entre ciblage GFP (t) et non- ciblant (nt) les nucléases Cas en présence (Acr) et en l'absence (-) d'Acrs.

Pour mesurer la réponse SOS dépendante de RecA, la nucléase-ARNcr, les plasmides cibles/non cibles (pCBS276/pCBS3578, kanamycine) et les plasmides rapporteurs PrecA-gfp/no-gfp (pCBS3611/pCBS3616, ampicilline) ont été transformés séquentiellement dans E. coli BL21(AI). Les plasmides pCBS273 et pCBS3588 (chloramphénicol) ont été utilisés pour exprimer les nucléases SuCas12a2 et LbCas12a, respectivement. Lors de la mesure de la réponse SOS dépendante de RecA en présence de LsCas13a, le plasmide d'expression de nucléase pCBS361 (chloramphénicol) a été utilisé. Les plasmides cibles/non cibles pCBS2004/pCBS612 (ampicilline) et les plasmides PrecA-gfp/no-gfp pCBS2000/pCBS2002 (kanamycine) ont été utilisés. Tout d'abord, les cellules ont été cultivées dans du milieu LB avec du glucose à 0,2 % pour inhiber l'expression des nucléases et de l'ARNc. Les bactéries ont été recueillies à partir des cultures d'une nuit (15 ml) par centrifugation à 5 000 g pendant 2 min et remises en suspension dans du LB frais. Ensuite, 200 ul de milieu LB frais ont été inoculés sur des plaques à 96 puits avec les bactéries remises en suspension à partir des cultures d'une nuit. Ces cultures ont été cultivées en présence de chloramphénicol, de kanamycine et d'ampicilline, de chloramphénicol et d'ampicilline, ou sans antibiotique. Pour l'induction de l'expression de la nucléase et de l'ARNc, 1 mM d'IPTG et 0,2 % de l-arabinose ont été ajoutés.

Les cultures ont été cultivées à 37°C sous agitation vigoureuse. Les mesures de DO600 et de fluorescence (excitation : 485/20, émission : 528/20) ont été recueillies toutes les 5 min sur le lecteur de plaque BioTek Synergy H1. Quatre répétitions biologiques ont été mesurées par condition expérimentale.

Pour déterminer si un changement de fluorescence s'est produit à la suite du ciblage de la nucléase, la fluorescence de fond collectée pour les cultures avec le plasmide PrecA-no-gfp (pCBS3616/pCBS2002) a d'abord été soustraite des valeurs obtenues pour les cultures avec les plasmides exprimant la GFP pour chaque point de temps (pCBS3611/pCBS2000). Ensuite, les valeurs de fluorescence ont été divisées par les valeurs OD600 de la cible correspondante et des cultures non cibles. La signification statistique a été déterminée à l'aide du test t de Welch avec une variance inégale.

En parallèle, nous avons effectué un test de clairance du plasmide avec les cultures lavées pendant la nuit (Fig. 9b supplémentaire), comme décrit ci-dessus. Pour la dilution étalée la plus faible, des cultures à une DO600 d'environ 0,1 ont été utilisées.

Pour les mesures de cytométrie en flux, les cellules E. coli BL21(AI) ont été séquentiellement électroporées avec les plasmides codant pour la nucléase et cible/non cible. Les plasmides pCBS273 et pCBS3588 exprimant SuCas12a2 et LbCas12a ont été utilisés, respectivement. Le plasmide cible pCBS273 et le plasmide non cible pCBS3578 ont été utilisés. Pour les expériences impliquant LsCas13a, le plasmide d'expression de nucléase pCBS361 a été utilisé en combinaison avec le plasmide cible pCBS2004 et le plasmide non cible pCBS612. Après transformation plasmidique, les bactéries E. coli ont été récupérées dans du milieu SOC et cultivées pendant une nuit dans du LB avec du chloramphénicol, de la kanamycine et du glucose à 0,2 %. Ensuite, les cellules ont été collectées à 5 000 g pendant 2 min et remises en suspension dans du LB frais. Les bactéries remises en suspension ont été utilisées pour inoculer des cultures de 15 ml à une DO6oo d'environ 0,01. Ces cultures ont été cultivées à 37 ° C sous agitation à 220 tr / min pendant 6 h sans antibiotiques avec 1 mM d'IPTG et 0, 2% de l-arabinose. Toutes les 2 h, la DO600 des cultures a été mesurée et des échantillons de 500 µl ont été prélevés et centrifugés pendant 3 min à 5 000 g. Les culots cellulaires ont ensuite été remis en suspension dans du PBS 1X contenant 2 µg ml-1 DAPI (Thermo Fisher Scientific, 62248). Les cellules remises en suspension ont été colorées pendant 10 min dans l'obscurité, après quoi 10 µl ont été transférés dans 240 µl de PBS 1X sur une plaque à 96 puits. La fluorescence DAPI a été mesurée à l'aide du cytomètre en flux Cytoflow Novocyte Quanteon comme émission dans le spectre Pacific Blue (455 nm). Des données concernant la diffusion vers l'avant (FSC) et la diffusion latérale ont également été recueillies.

Les données résultantes ont été analysées en Python. Tout d'abord, des grappes de bactéries présentant des signaux FSC et Pacific Blue distincts ont été identifiées à l'aide d'un regroupement spatial basé sur la densité d'applications avec bruit (DBSCAN; https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.cluster.DBSCAN.html). Ensuite, les rapports entre le Pacific Blue et le signal FSC pour chaque point de données et le pourcentage de points de données dans chaque groupe ont été analysés à partir des données de regroupement. Les valeurs résultantes ont été tracées sous la forme de graphiques à bulles. Au total, 60 000 événements par échantillon ont été analysés.

Les bactéries mortes et viables ont été estimées à l'aide du kit de viabilité et de comptage LIVE/DEAD BacLight Bacterial (Molecular Probes, L34856). Les mesures ont été réalisées à l'aide du cytomètre en flux Cytoflow Novocyte Quanteon. Les bactéries E. coli BL21(AI) ont été transformées avec une nucléase, un ARNc et des plasmides d'expression cibles ou non cibles. Pour exprimer SuCas12a2 et LbCas12a avec un guide cible, les plasmides pCBS273 et pCBS3588 ont été utilisés, respectivement. Le plasmide d'expression cible pCBS2004 et le plasmide d'expression non cible pCBS612 ont été utilisés. Pour exprimer LsCas13a avec des guides cibles et non cibles, les plasmides pCBS273 et pCBS3578 ont été utilisés, respectivement. Les cultures contenant des combinaisons de nucléase-guide et de plasmides cibles ont été cultivées pendant environ 16 h avec 0, 2% d'inhibiteur de glucose dans quatre répétitions biologiques. Ensuite, 1 ml de chaque culture a été recueilli par centrifugation à 5 000 g pendant 3 min. Le culot résultant a été remis en suspension dans 1 ml de milieu LB frais. Un total de 60 ul de cette suspension a été utilisé pour inoculer 20 ml de LB. Trois cultures ont été cultivées pendant 2 h à 37 ° C avec une agitation constante à 220 tr/min. L'expression des nucléases et des guides a été induite avec 0,2 % d'arabinose et 0,01 mM d'IPTG. Après 4 h, la DO600 des cultures a été mesurée. Un volume des cultures correspondant à une DO600 de 1,0 a été collecté et traité comme décrit dans le manuel du kit. En bref, des échantillons de la culture bactérienne ont été centrifugés à 10 000 g pendant 3 min pour sédimenter les cellules. Le surnageant a été éliminé et le culot a été remis en suspension dans 1 ml de NaCl à 0,85 %. En tant que témoin pour les cellules mortes, le culot spectate a d'abord été remis en suspension dans 300 ul de NaCl à 0, 85%, puis dans 700 ul d'alcool isopropylique à 70% (suspension de cellules mortes). Les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant 60 min, avec un mélange toutes les 15 min. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés à 10 000 g pendant 3 min et lavés dans 1 ml de NaCl à 0,85 %, suivis d'une autre centrifugation. Enfin, les échantillons ont été remis en suspension dans 0,5 ml de NaCl à 0,85 %. Un millilitre du mélange maître pour la coloration des cellules contenait 977 µl de NaCl à 0,85 %, 1,5 µl de composant A (coloration d'acide nucléique SYTO 9 3,34 mM), 1,5 µl de composant B (iodure de propidium 30 mM (PI)), 10 µl de composant C (billes) et 10 µl de l'échantillon. Ces réactions ont été incubées pendant 15 min à température ambiante à l'abri de la lumière. La fluorescence a été recueillie dans les canaux vert (fluorescéine pour SYTO 9) et rouge (Texas Red pour PI). Les cellules mortes de chaque échantillon ont été sélectionnées sur la base du témoin de suspension de cellules mortes traité avec de l'alcool isopropylique. Le pourcentage de cellules mortes colorées avec PI a été calculé à partir du nombre total d'événements sans les billes. Au total, 50 000 événements ont été comptés par échantillon.

Des échantillons correspondant à 1 ml de culture à une DO6oo de 0,4 cultivée pour la coloration morte/vivante, comme décrit ci-dessus, ont été collectés et centrifugés à 10 000 g pendant 3 min. Les granulés résultants ont été congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à un traitement ultérieur. L'ARN total a été extrait en utilisant 1,5 ml de Trizol et 1,5 ml d'éthanol avec le kit Direct-zol RNA Miniprep (R2051, Zymo), selon les instructions du fabricant. L'ARN a ensuite été purifié à l'aide du kit RNA Clean & Concentrator-5 (R1013, Zymo). Un total de 0,5 µg d'ARN de chaque échantillon dans 5 µl a été combiné avec 2,5 µl de colorant de chargement d'ARN, chauffé à 70 °C pendant 10 min puis refroidi sur de la glace pendant 2 min. L'échelle RNA High-Range qui a été utilisée a également été traitée thermiquement. Les échantillons dénaturés (5 µl) et le leader (3 µl) ont été chargés sur un gel TBE à 1 %. Le gel a été exécuté pendant 40 min à 120 V. Ensuite, le gel a été coloré pendant 30 min dans du bromure d'éthidium, lavé pendant 10 ml et imagé. Les images de gel ont été analysées à l'aide de GelAnalyzer v.19.1 (www.gelanalyzer.com).

Pour la microscopie confocale, les cellules ont été cultivées comme décrit ci-dessus pour la cytométrie en flux. A 2 h d'intervalle, 500 µl de chaque culture ont été prélevés et centrifugés à 5 000 g pendant 3 min. Ensuite, les bactéries ont été diluées à peu près à la même densité cellulaire et colorées avec 2 µg ml-1 de colorant FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320) et 1 µg ml-1 de DAPI (Thermo Fisher Scientific, 62248). L'imagerie a été réalisée sur le microscope confocal inversé Leica DMi6000B TCS-SP5 II à un grossissement ×1 000.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données NGS du test de déplétion PAM et les données de séquençage de l'ARNc ont été déposées au NCBI GEO sous le code d'accession GSE178536. Toutes les autres données à l'appui des conclusions de l'article et des informations supplémentaires sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

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Nous remercions K. Makarova pour ses conseils sur la dénomination de Cas12a2 et pour ses commentaires sur les analyses phylogénétiques ; L. Fläxl pour son aide à la transcription-traduction ; L. Ostertag pour son aide à la traduction des surnoms ; F. Ttofali pour son aide dans le clonage et les tests de plasmide ; D. Collias pour des suggestions concernant la traduction de nicking ; et A. Pawluk et A. Özcan pour leurs commentaires sur le manuscrit. Les plasmides pET28a-mH6-Cas12g1 (plasmide Addgene, 120879) et pACYC-Cas12g1 (plasmide Addgene, 120880) ont été offerts par Arbor Biosciences. Le plasmide pC001 était un cadeau de F. Zhang (plasmide Addgene, 79150). Ce travail a été soutenu par une subvention du Consolidator ERC (865973 à CLB), le Darpa Safe Genes Program (HR0011-17-2-0042 à CLB), les National Institutes of Health (R35GM138080 à RNJ), l'Organisation des Pays-Bas pour la recherche scientifique (NWO) et la subvention Rubcon (Project 019.193. ation (à CLB). Les points de vue, opinions et/ou constatations exprimés ne doivent pas être interprétés comme représentant les points de vue ou politiques officiels du ministère de la Défense ou du gouvernement des États-Unis.

Financement en libre accès fourni par le Helmholtz Center for Infection Research GmbH (HZI).

Benjamin N. Gray

Adresse actuelle : Syngenta, Research Triangle Park, NC, USA

Institut Helmholtz pour la recherche sur les infections basées sur l'ARN, Centre Helmholtz pour la recherche sur les infections, Würzburg, Allemagne

Oleg Dmytrenko, Elena Vialetto, Ioannis Mougiakos, Katharina G. Wandera, Johannes Weber, Thomas Gaudin & Chase L. Beisel

Benson Hill, St Louis, Missouri, États-Unis

Gina C. Neumann, Benjamin N. Gray et Matthew B. Begemann

Département de chimie et de biochimie, Utah State University, Logan, UT, États-Unis

Thomson Hallmark, Dylan J. Keiser, Valerie M. Crowley, Hannah Domgaard, Josie Metcalf et Ryan N. Jackson

Faculté de médecine, Université de Würzburg, Würzburg, Allemagne

Chase L.Beisel

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Conceptualisation : OD, GCN, RNJ et CLB Méthodologie : OD, GCN, VMC, JM, HD, TH et DJK Découverte bioinformatique d'orthologues Cas12a2 : BNG et OD Première observation d'infection bactérienne abortive : GCN Analyse phylogénétique : OD Découverte du ciblage d'ARN : OD, DJK, RNJ et CLB Expérimentation dans E. coli : OD, GCN, VMC, EV, IM et JW Expérimentation dans transcription–traduction : KGW, JW et OD Expérimentation in vitro : VMC, DJK, HD, TH et JM Nick-diagnostic de traduction : TG Rédaction – brouillon original : OD, VMC, RNJ et CLB Rédaction – relecture et édition : tous les auteurs. Visualisation : OD, DJK, TH, HD, RNJ et CLB Supervision : MBB, RNJ et CLB Financement acquisition : RNJ et CLB

Correspondance à Matthew B. Begemann, Ryan N. Jackson ou Chase L. Beisel.

Benson Hill a un brevet accordé (US 9,896,696) et a déposé des demandes de brevet supplémentaires. GCN et MBB sont des employés de Benson Hill. OD, RNJ et CLB ont déposé des demandes de brevet provisoires sur les concepts connexes, avec un brevet délivré (US 9,896,696). CLB est co-fondateur de Locus Biosciences et membre du conseil consultatif scientifique de Benson Hill. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Raymond Staals et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

L'arbre phylogénétique généré à l'aide de séquences d'acides aminés est la version annotée de la figure 1a. Les régions ombrées désignent les orthologues Cas12a2 (rouge), Cas12a (bleu) et Cas12b (gris). Les cercles bleus et rouges indiquent les systèmes qui contiennent à la fois Cas12a2 et Cas12a. Les valeurs d'attente d'amorçage de transfert (TBE) sont affichées au niveau des nœuds.

a, Différentes paires guide:cible testées sous sélection antibiotique de la nucléase et des plasmides cibles ou uniquement du plasmide nucléase. b, Réduction de la transformation plasmidique par les orthologues Cas12a2 testés sous sélection antibiotique de la nucléase et des plasmides cibles. c, Effet de l'échange de répétitions directes associées aux nucléases SuCas12a2 et Cas12a sur la transformation plasmidique. La nucléase indiquée, le crARN codant pour la répétition et la cible ont été soumis au test d'interférence plasmidique traditionnel (gauche) et modifié (droite) dans E. coli. d, diagramme des plasmides cibles et non cibles utilisés dans le test de clairance des plasmides illustré en e. e, Impact d'un promoteur et d'un terminateur en amont du site cible sur la clairance du plasmide par SuCas12s2 et LbCas12a. f, diagramme des réactions TXTL acellulaires utilisées pour évaluer l'impact de l'expression cible sur le silence collatéral de Cas12a2 illustré en g. g, L'effet du silençage collatéral par SuCas12a2 dans TXTL en fonction de la présence d'un promoteur, d'aucun promoteur ou d'un terminateur en amont du site d'expression cible. Les diagrammes de dispersion représentent les moyennes de 4 répétitions techniques ± sd Sauf indication contraire, les valeurs sont des moyennes ± sd d'au moins 3 expériences indépendantes lancées à partir de colonies séparées. ns : p > 0,05, * : p < 0,05, ** : p < 0,005 calculé avec le test t de Welch unilatéral.

a, Schéma de la structure secondaire prédite de la répétition directe SuCas12a2. Les sites de clivage de SuCas12a2 et Cas12a sont indiqués. b, Couverture de séquençage de l'ADNc cartographié sur le locus crRNA dans E. coli BL21(AI) exprimant SuCas12a2. La couverture de toutes les lectures filtrées par la qualité au-dessus de 10 nt ainsi que les lectures entre 10 et 55 nt mappées sur le brin plus sont indiquées. c, Traitement in vitro d'un pré-ARNc de 56 nt incubé pendant 60 min en présence d'apo-SuCas12a2 ou de deux mutants censés perturber le traitement de l'ARNc. d, clivage in vitro par SuCas12a2 d'un pré-ARNcr contenant trois répétitions directes et trois espaceurs (3 × ARNcr). Les réactions contenant apo-SuCas12a2 sont indiquées. Les points de temps après mélange de la réaction de clivage avec apo-SuCas12a2 sont indiqués. Les tailles estimées des pré-ARNc et des ARNc après clivage sont indiquées à gauche. Les deux dernières voies contiennent de l'ARN extrait de SuCas12a2 co-exprimé avec un tableau CRISPR. La différence de taille entre la bande majeure d'ARNr dans le test in vitro (~ 67 nt) et l'ARNc extrait de SuCas12a2 lié à l'ARNr exprimé par E. coli (~ 42) peut être due à une coupe supplémentaire par des exonucléases 3 'dans la cellule. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

a, Activités collatérales non spécifiques de SuCas12a2, LbCas12a, LwaCas13a et AbCas12g vis-à-vis de l'ADNss, de l'ADNds et de l'ARN non ciblés marqués par FAM en présence d'ADNss, d'ADNds et d'ARN cibles. Toutes les réactions de clivage ont été conduites à 37°C sauf indication contraire. AbCas12g a été déclenché par l'ARN et l'ADNss et a présenté un clivage collatéral préférentiel de l'ARN par rapport à l'ADNss mais aucun clivage discernable de l'ADNds. b, clivage médié par SuCas12a2 au fil du temps des substrats non cibles de l'ARN marqué par FAM (en haut), de l'ADNsb (au milieu) et de l'ADNdb (en bas). Ces substrats sont clivés par SuCas12a2 grâce à son activité collatérale non spécifique. c, test de décalage d'électromobilité indiquant que SuCas12a2 et LbCas13a ne dégradent généralement pas l'ARNdb sans discernement. Les substrats non clivés et les produits clivés sont indiqués. d, Impact de la mutation des cystéines conservées dans le domaine prédit du doigt de zinc de SuCas12a2 sur l'activité collatérale déclenchée par l'ARN. Les cystéines mutées dans SuCas12a2 sont C1170S, C1173S, C1188S et C1191S. e, Essais de décalage d'électromobilité du plasmide pUC19 superenroulé avec SuCas12a2: ARNcr et différentes séquences d'ARN au fil du temps. Les séquences d'ARN comprennent : non-auto-cible (complémentaire à l'ARNg avec 3'GAAAG PFS), complément cible (complément de la non-auto-cible), non-cible (séquence d'ARN utilisée dans les tests de clivage trans), pas de PFS (ARN qui ne contient que le complément à l'ARNg sans 3'PFS), auto-PFS (complémentaire à l'ARNg avec 3'AUCUA PFS). Les séquences d'ARN peuvent être trouvées dans le tableau supplémentaire 1. SuCas12a2 (E1063A) avec la cible non-soi est inclus en tant que contrôle négatif. NN : témoin sans nucléase. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

a, Séquençage de la couverture des bibliothèques PFS à partir des cultures cibles et témoins d'E. coli. Les données de deux répétitions biologiques sont présentées. b, Corrélation entre les scores de déplétion obtenus à partir des deux bibliothèques répliquées. c, Le profil PFS complexe reconnu par SuCas12a2. Voir réf. 65 pour plus d'informations sur l'interprétation des roues PAM. Compte tenu de la complexité du profil PFS, quatre roues PAM différentes sont présentées en fonction de chaque nucléotide à la position -1 PFS. d, Validation des séquences PFS sélectionnées identifiées dans l'écran PFS avec SuCas12a2 en utilisant le test de clairance plasmidique. Les valeurs sont des moyennes ± écart-type de ≥ 3 expériences indépendantes démarrées à partir de colonies séparées. ns : p > 0,05, * : p < 0,05, ** : p < 0,005 calculé avec le test t de Welch unilatéral.

a, Impact de la longueur du guide sur la clairance du plasmide. La séquence de guidage est représentée par des lettres bleues. La longueur standard du guide crRNA basée sur le traitement du crRNA (Extended Data Fig. 3) est de 24 nts. b, réduction de la transformation du plasmide par SuCas12a2 et LbCas12a en présence d'un PAM/PFS partagé, d'un PFS spécifique à Cas12a2 et de mésappariements avec la cible sous le plasmide cible et le plasmide nucléase ou la sélection du plasmide nucléase uniquement. Les valeurs sont des moyennes ± sd d'au moins 3 expériences indépendantes démarrées à partir de colonies séparées. ns : p > 0,05, * : p < 0,05, ** : p < 0,005 calculé avec le test t de Welch unilatéral.

a, gel d'agarose à 1 % résolvant l'ARN total extrait de E. coli BL21(AI) exprimant SuCas12a2, LbCas12a et LsCas13a dans des conditions cibles (T) et non cibles (NT). L'expression des nucléases et de l'ARNc a été induite avec 10 nM d'IPTG et 0,2 % d'arabinose pendant 2 h. Les puits individuels pour chaque condition représentent des répliques biologiques. Les tailles de nucléotides sont basées sur une échelle d'ARN résolue. Pool d'ARNs : pool d'ARN comprenant des ARNt et d'autres petits ARN. b, Quantification des intensités de bande à travers les 4 répétitions expérimentales indépendantes à partir de colonies séparées. La signification a été calculée à l'aide du test t de Welch bilatéral (ns : p > 0,05, * : p < 0,05, ** : p < 0,005).

Les cultures ont été recueillies 4 h après l'inoculation et l'induction de la nucléase et de l'ARNc. Avant l'analyse, les cellules ont été colorées au DAPI. La sous-population avec un faible DAPI et une diffusion vers l'avant élevée reflète des cellules allongées avec une teneur en ADN réduite. Les tracés de contour sont représentatifs de 4 expériences indépendantes.

Une filamentation étendue peut être observée avec les bactéries contenant le plasmide d'expression cible et exprimant SuCas12a2 et l'ARNc cible 2 h et 4 h après l'induction. Dans chaque image superposée, la coloration de l'ADN fluorescent (DAPI) est indiquée en bleu et la coloration de la membrane (FM4–64) est indiquée en rouge. Les images appariées sont représentatives de 2 expériences indépendantes.

a, Courbe de progression pour le clivage activé par l'ARN cible de la balise ARN par SuCas12a2 à 37 ° C. b, Limite de détection de SuCas12a2 à l'aide d'une balise ARN telle que déterminée à l'aide de la méthode de vitesse46. Les vitesses ont été obtenues par analyse de régression des régions linéaires des courbes de progression. La méthode de la vitesse a été utilisée pour déterminer toutes les limites de détection rapportées. c, Courbe de progression pour le clivage activé par l'ARN cible de la balise ssDNA par Cas12a2 à température ambiante (RT). Les barres d'erreur dans a et c représentent la moyenne et l'écart type de trois mesures indépendantes. Les barres d'erreur en b représentent l'erreur standard pour l'ajustement linéaire de trois mesures indépendantes. d, Vue d'ensemble du test de détection basé sur la coupure de plasmide et la traduction de coupure. e, Substrat plasmidique résolu incubé avec le RNP ca33Cas12a2-gRNA (100 nM) et l'ARN indiqué (1 nM). Le temps d'incubation avant d'initier la traduction de nick est indiqué pour chaque condition expérimentale. La première voie (plasmide uniquement) représente le plasmide incubé sans RNP. ARN1 non ciblé : ARNg COA1 et ARN du SRAS-CoV-2. ARN2 non cible : ARNg SARS-CoV-2 et ARN COA1. f, Mesures de fluorescence après translation de coupure avec les différentes réactions de e. Les valeurs de fluorescence ont été normalisées à celles du contrôle plasmidique uniquement. Pour le contrôle positif, le plasmide a été soumis à un mélange de DNase I et d'ADN polymérase I. Les valeurs sont des moyennes ± sd de 3 expériences indépendantes. La significativité a été calculée à l'aide du test t de Welch bilatéral par rapport à une valeur de 1 (ns : p > 0,05, * : p < 0,05, ** : p < 0,005). Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

Données de source de gel.

Fig. supplémentaires. 2–9 et la légende de la Fig. 1 supplémentaire.

Tableaux supplémentaires 1 à 5.

Fichier Fasta listant les séquences d'acides aminés Cas12a2, Cas12a et Cas12b.

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Réimpressions et autorisations

Dmytrenko, O., Neumann, GC, Hallmark, T. et al. Cas12a2 provoque une infection abortive par la destruction de l'ADNdb déclenchée par l'ARN. Nature 613, 588–594 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05559-3

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Reçu : 13 juin 2022

Accepté : 11 novembre 2022

Publié: 04 janvier 2023

Date d'émission : 19 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-022-05559-3

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Nature (2023)

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